在生物制药领域，对宿主细胞蛋白(HCPs)的精准分析与控制是确保药物安全与有效性的关键环节。各国法规都有关于HCPs的论述，要求必须对生物药品进行分析和纯化，以将宿主细胞蛋白HCPs降低到可接受的水平。

不同监管机构宿主细胞蛋白(HCPs)法规要求:

• 《中国药典》(2020版)三部规定：针对CHO细胞，HCPs残留需要<0.05%(相当于小于500ppm)；针对E.coli，HCP残留需要<0.01%。
• 美国药典USP<1132>章节规定：用一种灵敏度较高的方法检测药品中的HCPs，其含量应该低于检测限(通常小于100ppm，即1mg总蛋白中HCPs含量应小于100ng，也即<0.01%)。
• 欧洲药典EP 2.6.34中规定：在生物制品中，HCP的含量应当小于0.1%。
• 国际人用药品注册技术协调会(ICH)指南：ICH Q6B指出，需要根据ICH准则采用敏感且经过验证的有效方法来监控残留的HCPs，其残留量通常要求小于100ppm。
• ELISA是各国药典推荐的在生物制品中检测残留HCPs的方法，可以测定HCPs的总量。并且ELISA的操作简便，是经典的免疫学检测方法。但ELISA检测HCPs也有方法的局限性，比如不能从ELISA的结果中知道样品中有哪些HCPs，或者用于检测的抗体与哪些HCPs发生了免疫反应。因此，监管部门要求在使用ELISA检测过程中HCPs残留含量时，不仅要通过方法学验证证明试剂盒的准确度，精密度，灵敏度等，而且还需要证明使用的HCPs抗体有广泛的反应性，即HCPs抗体覆盖率。
  

图 1 HCP ELISA试剂盒检测流程

什么时候做HCPs抗体覆盖率验证？

美国药典USP<1132>和欧洲药典EP2.6.34. HOST-CELL PROTEIN ASSAYS将HCPs检测方法分为：商业化试剂盒、产品/工艺专属性方法和平台化方法。并指出在产品开发的不同阶段，推荐采用不同的ELISA试剂盒用于HCPs的检测。

USP<1132>提到在没有平台化方法的情况下可以在临床前、临床I期、II期使用商品化试剂盒；在临床III期/工艺验证及产品上市后，由于商业化的通用HCP检测试剂盒抗体的覆盖率往往不足等局限性，需要考虑结合细胞类型及工艺特异性等因素，使用平台化方法或针对上游工艺开发的产品/工艺专属性方法。

而在临床II期后若是需要继续使用商品化试剂盒，就需进行HCPs抗体覆盖率验证来评估试剂盒是否可以继续用于质量监控。通常推荐在临床II期末或者临床三期前的这个阶段去做覆盖率验证，此时生产工艺已经固定并且有相对充足的时间。

图2 USP <1132>产品开发的不同阶段HCP检测方法的建议

HCP覆盖率验证的不同技术路线

传统的分析方法采用2D Western blot进行覆盖率验证，是基于等电点和分子量不同的原理，蛋白在凝胶上通过SDS-PAGE方法被分离。其中一张胶被银染，另一张被转到PVDF膜上，并结合ELISA试剂盒中的抗体进行Western Blotting检测。但因其固有的方法学限制和技术挑战，往往难以全面、准确地评估多克隆抗体对HCPs的覆盖范围。

2D WB方法限制因素：

• 负载能力低
• 样品经过前处理会破坏蛋白天然表位
• HCPs结合到PVDF膜上导致损失部分检测到的抗体信息
• 难以完全将PAGE凝胶与WB图片对齐
• 特异性差，显著低估真实抗体覆盖率

为了克服这一难题，Cygnus Technologies于2014年创新性地推出了抗体亲和提取(Antibody Affinity Extraction，AAE™)技术，目的是提高细胞培养收获液中总HCPs混合物的灵敏度和覆盖率评估，并可以检测对下游工艺特异性HCPs的反应性，这些通常也是最为关注的HCPs。与2D-PAGE和2D-WB的灵敏度受负载能力等限制不同，AAE™的灵敏度可高出100倍以上，因为它能够提取和浓缩大量样品。

表 1 AAE与2D-WB覆盖率技术路线对比

AAE分析流程首先将多克隆抗体共价固定在色谱柱上。然后对色谱柱进行条件调节，以防止抗体的显著浸出并极大地减少任何非特异性结合。原始未变性的HCPs样品通过色谱柱与抗体进行结合，随后用酸洗脱。通过结合和洗脱，HCPs样品再次在柱上循环，直到没有其他HCPs被结合。所有收集的HCPs洗脱液再汇集、交换缓冲液并浓缩回原始样品体积，为后续的分析提供高质量的样本。在收集到HCPs样本后，可以选择通过2D-PAGE+银染或MS质谱进行后续分析。

图3 USP <1132>产品开发的不同阶段HCP检测方法的建议

抗体对下游HCPs的反应性和AAE-MS™的HCPs鉴定

   AAE™技术的优势不仅在于其高灵敏度，更在于其强大的预测能力和广泛的应用前景。通过AAE-MS™获得的覆盖率的结果更高、更真实，可以更准确地预测抗HCPs抗体在ELISA中的表现。并且，AAE™与质谱联用(AAE-MS™)能够识别收获材料中与抗体反应的HCPs，并获得蛋白质的分子量和等电点(pI)信息，可以评估纯化过程中持续存在的单个HCPs，并优化下游纯化工艺。

图4 F650S HEK2 93抗体覆盖率验证

值得一提的是，AAE™技术在检测并证明对单个下游HCP的反应性方面表现出色。更主要的是质谱可以对样品中是否存在潜在高风险的HCPs做出鉴定并提供这些蛋白的注释信息。通过AAE™技术，能够更准确地识别和量化这些高风险HCPs。这些通过特定纯化过程持续存在的高风险HCPs对于患者安全、药物功效和稳定性至关重要，无论是药物研发人员还是监管人员都能通过这一技术清楚地了解工艺中某个HCP的残留情况，从而为药物的研发和生产提供强有力的支持。

表 2 CHO细胞高风险HCPs

AAE-MS™在药物原液和过程样品监控中的应用

AAE-MS™也可以对药物原液中HCPs富集的同时去除了大部分原料药。去除原料药极大地提高了通过2D-PAGE和质谱分析识别单个HCPs的能力，因为药品通常以104-106的倍数掩盖HCPs。AAE-MS™是一种更客观和直接的方法检测和鉴定原料药中任何潜在的HCPs杂质以帮助优化下游纯化工艺。

图5 AAE对药物原液中HCPs的富集

图6  AAE-MS™对药物原液中高风险HCPs的富集和鉴定

总之，抗体亲和提取(AAE™)技术以其卓越的性能和广泛的应用前景，正在逐步成为生物制药领域HCPs分析的新标准。它不仅能够克服传统方法的局限性，更在灵敏度、预测能力和应用深度上实现了显著提升。随着技术的不断发展和完善，相信AAE™将在未来为更多药物的研发和生产贡献力量，为患者带来更加安全、有效的治疗方案助力。

支持文献

[1] USP <1132> Residual Host Cell Protein Measurement in Biopharmaceuticals.

[2] USP <1132.1> Residual Host Cell Protein Measurement in Biopharmaceuticals by Mass Spectrometry.

[3] EP-2.6.34. Host-Cell Protein Assays.

[4] Host Cell Protein Analysis: Immunoassays and Orthogonal Characterization By Antibody Affinity Extraction and Mass Spectrometry Methods

[5] Antibody Affinity Extraction (AAE™) - A superior alternative to 2D Western blot for determination of polyclonal anti-HCP reactivity.

[6] Antibody Affinity Extraction (AAE™) Empowers HCP Identification by Mass Spectrometry.